• محیط آزمایشگاه
  • سلامت
  • نمونه گیری
  • پذیرش
  • 222
  • cobas 6000
  • 66
  • 20
  • 77

کاپیلاری الکتروفورز

Khatam Pathobiology Laboratory

 

 

الکتروفورز چیست انواع روش

 

 

 

الکتروفورز ( به انگلیسی Electrophoresis ) به حرکات ذرات در یک مایع تحت میدان الکتریکی گویند. پس از استخراج ماده ژنتیک، مرحله بعدی تفکیک آن به قطعات تشکیل دهنده و شناسایی هر قطعه است. همچنین در هنگام بررسی پروتئین های سلولی نیز نیاز به تفکیک انواع پروتئین ها از هم است. به سبب این که ماکرومولکول های زیستی مانند DNA و پروتئین ها باردار هستند می‌توان با قرار دادن آنها در یک میدان الکتریکی، آنها را بر اساس خواص فیزیکی مانند شکل فضایی، وزن مولکولی و بار الکتریکی، تفکیک کرد. برای این منظور از روشی به نام الکتروفورز استفاده می شود.

 

فرایند الکتروفورز

 

روش های مختلف الکتروفورزی برای تفکیک و مطالعه بیومولکول ها اعم از اسید های نوکلئیک یا پروتئین ها ابداع شده است که در زیر به معرفی انواع متداول آن می پردازیم.

 

الکتروفورز سطحی

از یک نوار کاغذی یا استات سلولزی بعنوان فاز ثابت استفاده می شود. دو روش فوق جز در برخی کارهای پژوهشی کاربرد چندانی ندارند.

 

 

الکتروفورز ژل

از یک محیط نیمه جامد (ژل) به عنوان فاز ثابت استفاده می شود. این نوع الکتروفورز برحسب نوع ژل به کار گرفته شده به دو نوع الکتروفورز ژل پلی اکریل آمید (PAGE) و الکتروفورز ژل آگارز تقسیم می شود. الکتروفورز PAGE دارای قدرت تفکیک بسیار بالایی بوده و برای تفکیک پروتئین ها و اسید های نوکلئیک به کار گرفته می شود. به منظور بررسی پروتئین ها با استفاده از PAGE، به سبب این که پروتئین ها دارای بارهای مختلفی هستند، معمولاً برای اینکه تفکیک فقط براساس وزن مولکولی انجام شود به بافر ماده شیمیایی SDS (سدیم دو دسیل سولفات) اضافه می شود. SDS مولکول بزرگی با بار منفی است. این ماده باعث واسرشت[۱] شدن پروتئین ها شده و به آنها متصل می شود. به ازای هر دو اسید آمینه، یک مولکول SDS به پروتئین متصل می‌شود که باعث القاء بار  منفی متناسب با وزن مولکولی به پروتئین می شود. هر چه غلظت پلی اکریل آمید بیشتر باشد قدرت تفکیک ژل بیشتر خواهد بود و مولکول های دارای وزن  مولکولی نزدیک به هم را بهتر تفکیک می‌نماید.

برای تفکیک اسید های نوکلئیک در صورت امکان از ژل آگارز استفاده می شود. تهیه ژل مزبور به مراتب سریع تر و آسان تر از ژل پلی اکریل آمید بوده و هزینه کمتری را در بر می‌گیرد. معمولاً برای تفکیک قطعات بزرگ DNA (بزرگ‌تر از ۵۰۰ جفت باز) در صورتی که هدف صرفاً بررسی کیفی و تفکیک باشد استفاده از ژل آگارز انتخاب اول است. برای تفکیک قطعات کوچک DNA دو رشته‌ای و قطعات DNA تک رشته ای از ژل پلی اکریل آمید استفاده می شود. قدرت تفکیک ژل های مزبور ارتباط مستقیمی با غلظت آن ها دارد. برای مثال، برای تفکیک قطعاتی به اندازه ۱۰۰ جفت باز از آگاروز ۳٪ و برای قطعات حدود ۲۰۰۰ جفت باز از آگارز ۸/۰ ٪ استفاده می شود. در صورتی که نیاز به تفکیک DNA به صورت تک رشته ای باشد، از مواد واسرشت کننده نظیر اوره، فرمالدهید یا فرمامید در ژل هم زمان با الکتروفورز استفاده می شود. به این نوع ژل ها، ژل واسرشت کننده می‌گویند. چنین ژل هایی پیچ و تاب‌های اسید های نوکلئیک را از هم باز کرده و بنابراین تفکیک مولکول ها فقط براساس طول و نه ساختار دوم انجام می شود. در این ژل ها مولکول های کوچک تر در مقایسه با مولکول های بزرگ‌تر، سریع‌تر حرکت کرده و مسافت بیشتری را طی می‌کنند. از روش PAGE برای بررسی جهش ها و تعیین توالی دی‌ ان‌ ای استفاده می شود.

 

 

الکتروفورز کافی

آند این دستگاه از جنس گرافیت است. همین ویژگی سبب کاهش چشمگیر قیمت آن شده است.

 

 

الکتروفورز در میدان الکتریکی ضربان دار

چنانچه اشاره شد، هر چه غلظت ژل کمتر باشد با آن می توان مولکول های بزرگتری را بوسیلة الکتروفورز ، تفکیک کرد. ولی در این رقت محدودیت وجود دارد به طوری که حتی با رقیق ترین ژل های آگاروز هم نمی توان مولکولهای DNA بزرگتر از 100 کیلو جفت باز را تفکیک کرد. برای این منظور از روشهای الکتروفورز در میدان الکتریکی ضربان دار استفاده می شودکه دارای انواع مختلفی است:

آ) الکتروفورز در میدان الکتریکی ضربان دار تک جهتی (UPFGE)

یکی از ساده ترین روشهای الکتروفورز در میدان الکتریکی ضربان دار، روش UPFGE می باشد. برای این روش از یک دستگاه ژل الکتروفورز افقی معمولی استفاده می شود. در UPFGE ، میدان الکتریکی در فواصل زمانی معین قطع شده و دوباره برقرار می شود. هنگامی که میدان برقرار است مولکول DNA بصورت گسترده در آمده و در جهت میدان حرکت می کند. با قطع شدن جریان الکتریکی، حرکت DNA متوقف شده و DNA فرصت می یابد تا به حالت هیئت فضایی خاص خود در آید ولی با برقراری مجدد جریان حرکت مولکول آغاز می شود. در زمانی که میدان الکتریکی برقرار نیست همة مولکولها فرصت نمی کنند بطور کامل به شکل فضایی خود در آیند هر چه مولکول کوچکتر باشد سریعتر می تواند به شکل فضایی خود در آید و از آن خارج شود. براین اساس می توان مولکولهای نسبتاً بزرگ را از هم تفکیک کرد. با استفاده UPFGE می توان مولکولهایی تا اندازه 400 کیلو جفت باز را از هم تفکیک کرد. از این روش الکتروفورزی در انالیز ژن های بزرک نظیر ژن کد کننده پروتئین دیستروفین که در پیدایش بیماری دیستروفی عضلانی نقش دارد، استفاده می شود.

ب) الکتروفورز در میدان الکتریکی معکوس (FIGE)

در روش FIGE، جهت میدان الکتریکی در فواصل زمانی معین ، معکوس می شود در این روش برای تفکیک مولکولهای کوچک از دامنه های زمانی کم استفاده می شود یعنی میدان الکتریکی بطور متناوب به مدت .5/. ثانیه در جهت مستقیم و به مدت 25/. ثانیه در جهت مخالف برقرار می شود. در مورد مولکولهای بزرگتر از زمانهای بیشتر ، 3 ثانیه به جلوو 1 ثانیه در جهت مخالف استفاده می شود. با این روش می توان مولکولهایی تا اندازه 800 کیلو جفت باز را از هم تفکیک کرد. 

ج) ژل اکتروفورز در میدان الکتریکی ضربان دار (PFGE)

PFGE یکی از متداولترین روشهای الکتروفورز در میدان الکتریکی ضربان دار است. در این روش از دو میدان الکتریکی که نسبت بهم بصورت عمود قرار گرفته اند، در فواصل زمانی معین بطور متناوب استفاده می شود. یکی از این میدانها در جهت بالا به پائین و دیگری در جهت چپ به راست قرار دارد. مولکولهایDNA پس از آنکه تحت تأثیر میدان اول حرکت کردند در اثر میدان دوم 90 درجه تغییر جهت داده و حرکت می کنند. در اثر این روش مولکولهای DNA با یک حرکت چرخشی خود، در طول ژل بصورت زیگ زاگ حرکت می کنند. در روش PFGE می توان مولکولهای بسیار بزرگی در اندازه بین 20 هزار تا 2 میلیون جفت باز را از از هم تفکیک کرد.

 

 

دستگاه الکتروفورز هوشمند

پس از سالها خدمت الکتروفورز ساده به علوم مولکولی، ناگزیر الکتروفورز هوشمند طراحی گردید. این سیستم قادر است. پس از رؤیت باندهای آبی رنگ DNA تماس تلفنی با کاربر خود برقرار نموده و دستور خاموش شدن را به صورت تلفنی دریافت کند. توانایی دیگر این سیستم حیرت برانگیز کنترل دمای بافر و مقدار بافر می باشد. این نوع الکتروفورز از طریق سیستم پمپینگ مقدار بافر نشت کرده به تشتک پایین را به تشتک بالا انتقال می دهد و از طریق E-cooler دمای مضر سیستم را کاهش می دهد.[2]

 

 

مزیت های الکتروفورز هوشمند

۱- اعلام هشدار پایان کار الکتروفورز
۲- خنک سازی الکترونیکی در کمترین حجم با استفاده از E-cooler ۲
۳- تنظیم مقدار بافر تشتک ها
۴- اعلام وضعیت های بحرانی از طریق تماس تلفنی خودکار
۵- اعلام هشدار قطع جریان برق الکترود ها

 

 

پانویس:

۱. واسرشت: معنی جدید این واژه در مقابل واژه دناتوره یا دِنی چر یا تقلیب به کار می‌رود و از اصطلاحات علوم زیست شناسی سلولی ملکولی و شیمی است. 
از آن جا که با تغییر ساختمان پروتئین ساختمان آن گاه به صورت غیر قابل برگشت تغییر می‌کند لذا واژه واسرشت به عنوان هرگونه تغییر در سرشت و طبیعت اصلی مولکول لحاظ می‌شود. ( واژه نامه پارسی ویکی www.parsi.wiki )